Batman là một siêu anh hùng có tính kỷ luật cao, thậm chí trong nhiều tình huống điều đó được đẩy đến mức cực đoan. Và không giết người, kể cả những tên tội phạm nguy hiểm, biến thái nhất là quy tắc nổi tiếng khi hành động của anh ấy. Đó là điều khiến Batman khác biệt với nhiều anh hùng khác. Nhưng không phải lúc nào quy tắc này cũng được áp dụng triệt để. Trong những số truyện đầu tiên, các nhân vật phản diện thường sẽ chết đi. Mãi cho đến Batman #4, điều này mới thay đổi.

Alfred Stryker là một nhân vật phản diện độc nhất xuất hiện trong Detective Comics #27. Vì đây là phần đầu của Batman nên không có quy tắc nào để nhân vật Bruce tuân theo. Bên cạnh đó, độc giả thời ấy cũng đang quen với cách làm cũ và thường chờ đợi các siêu anh hùng sẽ đi theo đúng khuôn mẫu từng đặt ra. Trong cuộc đối đầu cuối cùng của họ, Stryker bị Bruce đánh ngã vào thùng axit và chết. Trớ trêu hơn, chỗ axit đó lại là sản phẩm của chính công ty Stryker.

Detective Comics #29 đã mang đến cho Batman nhân vật phản diện đầu tiên không phải là một doanh nhân độc ác hay tội phạm cấp đường phố. Đối thủ của anh ấy là Dr. Death, bí danh của Karl Helfern, một nhà khoa học điên đã tạo ra vũ khí sinh hóa. Cái chết của hắn là một bi kịch khi Karl bị thiêu sống trong phòng thí nghiệm của mình sau khi Batman phóng hỏa để ngăn Dr. Death tạo ra nhiều vũ khí sinh hóa hơn. Điều ám ảnh là, Dr. Death vẫn cười lớn trong ngọn lửa và mắng Bruce là đồ ngốc dù đang bị bao quanh bởi biển lửa.

Trong Detective Comics #32 có cảnh Người Dơi rời thành phố Gotham để truy đuổi một nhân vật phản diện bí ẩn. Khi đến Hungry, Batman đã đi qua một dãy núi rộng lớn để tìm kẻ thủ ác được gọi là The Mad Monk - một con ma cà rồng thực sự. Khi chạm trán, Người Dơi đã buộc phải dùng các phương pháp cổ xưa để loại bỏ sinh vật này. Không giống các phiên bản hiện nay, Batman đã sử dụng súng trong khoảng thời gian này và bắn Mad Monk bằng một viên đạn bạc. Đây cũng là phương pháp được đồn rằng có thể giết chết được ma cà rồng.

KGBeast là một trong số ít nhân vật phản diện mà Batman đã giết nhiều lần. Lần đầu tiên xuất hiện trong Batman #420 là khi Batman chôn sống kẻ thủ ác và nói với KGBeast rằng hắn không đáng để anh ra tay trước khi đóng cánh cửa kim loại lớn lại. Căn phòng đó trở thành mồ chôn của tên ác nhân. Tuy nhiên, chi tiết này cùng cách hành xử này không thích hợp với Batman. Nhiều người hâm mộ cho rằng các tác giả đã quá tàn nhẫn với nhân vật và nó không giống với phản ứng của Người Dơi. Lần tiếp theo, cặp đôi gặp lại nhau trong phiên bản hiện đại (DC Universe Batman #57), nơi Bane sử dụng KGBeast để tiếp cận Batman và Nightwing. Kết quả, dù KGBeast cố gắng giải thích lý do với Batman, hắn vẫn bị bỏ mặc sau một cuộc chiến tàn khốc giữa hai người.

Final Crisis đã buộc Hiệp sĩ bóng đêm phải phá vỡ các quy tắc của chính mình để có được một trong những chiến thắng lớn quan trọng nhất mà Batman từng thực hiện trong DC Comics. Khi Darkseid cố gắng xâm chiếm lấy thế giới và sẵn sàng giết chết hàng tỷ người, Batman không còn lựa chọn nào khác ngoài việc hạ sát kẻ thủ ác. Đây là một trong số ít trường hợp cái chết của một nhân vật phản diện được dùng để biện minh cho hành động của Batman. Bởi anh ấy có thể cứu được cả thế giới chứ không chỉ Gotham. Cụ thể, Bruce đã sử dụng một viên đạn và súng được thiết kế đặc biệt để hạ gục Darkseid.

Là kẻ thù mang tính biểu tượng nhất của Người Dơi, Joker đã đóng vai chính trong một số loạt truyện tranh DC nhưng chỉ bị giết trong hai tác phẩm. Lần đầu tiên xuất hiện trong cốt truyện Red Rain, nơi Batman đối đầu với ma cà rồng. Joker đã bị biến thành một sinh vật của bóng đêm và sử dụng nó như một công cụ mới để cố gắng đánh bại Batman. Tuy nhiên, như thường lệ, Hiệp sĩ bóng đêm lại chiếm thế thượng phong và hạ gục Joker bằng một chiếc cọc gỗ. Lần tiếp theo Hoàng tử tội phạm xuất hiện trong Justice League: The Nail. Với dòng thời gian này, Joker có khá nhiều lợi thế nhưng đáng tiếc, lần này Batman đã tỏ ra không khoan nhượng và giết chết kẻ thù không đội trời chung của mình để chấm dứt đế chế khủng bố của hắn.